找到了这么多 eQTL，为什么还是解释不了复杂疾病？
先从 eQTL 说起。
如果某个遗传变异与一个基因的表达水平有关，我们就可以把这个变异视为该基因的 eQTL。过去，以 GTEx 为代表的大规模研究利用整体组织 RNA 测序（bulk RNA-seq），已经构建了相当丰富的人体基因表达调控图谱。
问题在于，一块组织并不是一种细胞。
外周血中同时存在 T 细胞、B 细胞、自然杀伤细胞（natural killer cell, NK cell）、单核细胞等多种细胞。当我们进行 bulk RNA-seq 时，得到的实际上是这些细胞表达信号混合后的平均结果。
如果一个遗传变异在所有细胞里的作用方向和强度都差不多，那么这种效应很容易保留下来。
但假设某个变异只在 CD4 T 细胞中明显影响一个基因，在 B 细胞中几乎没有作用，甚至不同细胞中的作用方向不同，那么把所有细胞混在一起之后，这种信号就可能被明显削弱。
该研究进一步指出，传统 eQTL 研究还有另一层选择偏倚：研究通常重点关注达到统计学显著性的 eQTL，而最容易达到显著性的，往往是效应较大、跨细胞类型共享的遗传调控信号。
这意味着我们已经建立起来的 eQTL 图谱，可能天然更容易看到那些“到处都有效”的调控效应，却更容易漏掉那些效应较弱、但高度依赖细胞环境的遗传效应。
恰恰是后一类效应，可能与复杂疾病更加相关。
这一次，研究人员不再只关注“哪个位点显著”
为了解决这个问题，研究团队开发了一种新的统计框架——细胞类型信息遗传混合模型分析（cell-type-informed genetic mixed-model analysis, CIGMA）。
它和传统 eQTL mapping 的思路有一个重要区别。
|
传统方法更关心： 哪一个 SNP 与哪一个基因的表达显著相关？ |
|
而 CIGMA 更关心： 一个基因表达的遗传差异中，有多少是不同细胞类型共同拥有的，又有多少会随着细胞类型而改变？ |
对于一个基因，CIGMA 将遗传效应拆成两部分：一部分是细胞类型共享效应（cell-type-shared effect），另一部分是细胞类型特异效应（cell-type-specific effect），并进一步计算遗传调控的“细胞类型特异性”。
研究首先分析了 OneK1K 队列的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）单细胞 RNA 测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据。
|
质量控制后，核心分析包括 928 名个体、10,288 个基因 和 7 种主要细胞类型，每名个体平均约有 1,190 个细胞。 |
cis 调控分析主要纳入距离基因体 500 kb以内、次要等位基因频率（minor allele frequency, MAF）>5% 的 SNP。
这里还有一个容易被忽略的技术细节：单细胞数据不仅存在人与人之间的差异，同一个人的同类细胞之间也存在大量波动。
研究人员发现，如果在模型中忽略这种细胞间变异（cell-to-cell variation），在接近真实数据的模拟条件下，估计出的 eQTL 遗传方差可以被低估约 90%。换句话说，要研究“遗传效应是否依赖细胞类型”，不仅需要把细胞分开，还必须认真处理单细胞数据本身的噪声结构。
第一组关键数字：cis 多数共享，trans 却多数“看细胞”
随后出现了这项研究中非常值得关注的一组结果。
对于 cis eQTL，也就是靠近目标基因的调控变异，研究估计其细胞类型特异性约为：
|
31.1% ± 1.3% |
换句话说，大约三成 cis 遗传调控效应具有明显的细胞类型依赖性，而大部分仍然可以跨细胞类型共享。
但是到了 trans eQTL，结果发生了明显变化。该研究将 trans 定义为位于目标基因其他染色体上的遗传变异，其细胞类型特异性达到：
|
59.4% ± 4.6% |
两者差异具有统计学意义，置换检验 P=0.001。
更值得注意的是，研究估计 trans eQTL 对基因表达遗传力的中位贡献约为 25%，而 cis eQTL 约为 3%。
为什么 trans 调控更依赖细胞类型？
一个合理的解释是，远端调控通常需要经过转录因子、信号通路和调控网络等更多中间环节，而这些调控系统本身就具有明显的细胞类型差异。
该研究还观察到了另一个连续变化：随着分析的 cis 区域距离转录起始位点（transcription start site, TSS）越来越远，eQTL 的细胞类型特异性逐渐增加。
当窗口缩小到 5 kb 时，特异性约为 30%；扩大到 1 Mb 时，上升到约 41%。距离核心启动子越远，调控似乎越容易受到细胞环境的影响。
Bulk RNA-seq 会把多少信号“平均掉”？
研究团队专门模拟了一个接近 bulk RNA-seq 的分析场景：把一个人的不同细胞类型重新混合起来，再分析遗传调控。
结果很直观。
|
在分细胞类型分析时，cis eQTL 的特异性大约为 30%；但把不同细胞重新混在一起之后，估计出的细胞类型特异性只剩下大约 5%。 |
这并不意味着那些遗传效应消失了。
变异仍然存在，基因仍然表达，遗传效应也仍然存在，只是当多个具有不同调控模式的细胞群体被平均以后，原本具有细胞类型依赖性的信号变得更难观察。
这也是为什么“测得更多样本”与“获得更正确的生物学分辨率”并不完全是一回事。
一个拥有数千甚至数万样本的 bulk RNA-seq 队列，可能非常有能力发现跨细胞类型稳定存在的调控效应；但对于只发生在特定细胞中的遗传调控，大样本并不能完全补偿细胞分辨率的缺失。
一个容易混淆的问题：表达特异，不等于遗传调控特异
这里还有一个很有意思的结果。
在单细胞研究中，我们经常通过差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）寻找细胞类型特征。
比如一个基因在 T 细胞中表达很高，在 B 细胞中表达很低，我们自然会把它视为具有明显的细胞类型特异性。
那么，细胞类型特异表达的基因，是不是也最容易拥有细胞类型特异性的 eQTL？
答案是：只有部分重叠。
研究比较了排名最高的 200 个细胞类型特异性 eGene（cell-type-specific eGene, cs-eGene）和排名最高的 200 个 DEG，最终只有：
|
14 个基因重叠 Spearman 相关系数仅为 ρ=0.19 |
这揭示了一个非常重要的区别：
|
“一个基因在哪种细胞中表达得更多”和“一个人的遗传差异在哪种细胞中更容易改变这个基因的表达”，不是同一个问题。 |
前者描述平均表达水平，后者描述遗传调控机制。
比如研究识别出的 CTLA4 就属于具有明显细胞类型特异性遗传调控的基因。CTLA4 编码调节 T 细胞反应的抑制性受体，其细胞类型特异性 eQTL 此前已经与多种免疫疾病产生联系。
另一个例子是 SMDT1。这个基因参与线粒体钙摄取，其已知 eQTL 在单核细胞受到病原刺激后的特定时间点表现出明显的环境和细胞状态依赖性。
遗传效应并不是一张静止的表。它更像一个条件函数：同一个基因型，在不同细胞环境中，可以对应不同的表达效应。
越重要、调控越复杂的基因，反而越容易表现出“细胞依赖性”
接下来的一组结果进一步增强了这个故事的生物学合理性。
研究人员考察了三个基因特征：进化约束、增强子数量以及基因调控网络连接度。
首先是 LOEUF（loss-of-function observed/expected upper bound fraction）。LOEUF 越低，意味着一个基因越不耐受功能缺失变异，也就是受到更强的进化选择约束。
结果显示：
|
受到更强进化约束的基因，eQTL 的细胞类型特异性反而更高。 |
与此同时，拥有更多增强子（enhancers）的基因，其 eQTL 特异性也更高；在共表达网络中连接程度更高的基因，也呈现类似趋势。
这几种特征具有一个共同点：它们通常意味着一个基因的调控体系更加复杂，对生物学系统产生的影响也可能更加广泛。
进一步进行基因本体（Gene Ontology, GO）分析后，低特异性的 eGene 主要富集于“细胞质翻译（cytoplasmic translation）”；而高特异性 eGene 则显著富集于 19 个 GO 条目，全部直接与免疫细胞功能有关，包括白细胞激活、淋巴细胞介导免疫和适应性免疫反应等。
这让“细胞类型特异性”不再只是一个统计参数。它开始对应具体的生物学功能。
最关键的问题来了：这些基因真的更接近复杂疾病吗？
如果细胞类型特异性 eQTL 只是一个有趣的调控现象，那么意义仍然有限。
研究真正想验证的是：
|
它们是否比传统 eQTL 更接近复杂疾病的遗传架构？ |
研究人员利用连锁不平衡评分回归（linkage disequilibrium score regression, LDSC），分析了 10 种复杂性状。
其中 7 种被该研究划为与血液和免疫系统联系较强的性状，包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis）、类风湿关节炎（rheumatoid arthritis）、原发性胆汁性肝硬化、多发性硬化（multiple sclerosis）、克罗恩病（Crohn's disease）、乳糜泻以及系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）；另外用身高、冠状动脉疾病和精神分裂症作为相对较少依赖血液细胞的比较性状。
结果是：
|
排名前 200 个 cs-eGenes 在 7 种血液相关性状中，有 4 种出现显著遗传力富集； 而在 3 种较少与血液相关的性状中，0 种出现显著富集。 |
更关键的是，排名前 200 的细胞类型共享 eGene 并没有观察到这样的复杂性状遗传力富集。
研究进一步使用抽象中介模型（abstract mediation model, AMM）估算不同基因集合介导的遗传力。
结果显示，前 200 个 cs-eGenes 可以介导血液相关复杂性状约：
|
9.0% 的遗传力 约 5 倍富集，P=0.003 |
相比之下，前 200 个 DEG 介导约 4.9%；细胞类型共享 eGene 和传统整体表达分析得到的 eGene 均约为 3.1%。
这组数据是整篇研究最值得重视的结果之一。
因为它提示：对于复杂疾病而言，我们过去最容易发现的那批“稳定、显著、到处都存在”的 eQTL，未必是最值得关注的调控层。
从“疾病相关基因”进一步走向“疾病相关细胞”
细胞类型分辨率还带来了另一个潜在价值：不仅可以分析“哪个基因与疾病有关”，还可以进一步分析：
|
这种遗传风险可能主要在哪类细胞中发挥作用？ |
研究一共发现了 6 个达到 q<0.1 的细胞类型—复杂性状遗传力富集组合。
例如，CD4 效应记忆 T 细胞（CD4 effector memory T cell, CD4ET）的相关基因对克罗恩病和溃疡性结肠炎遗传力出现富集。
而 CD8 效应记忆 T 细胞（CD8ET）以及 NK 细胞相关的细胞类型特异性遗传效应，则富集于 SLE 的遗传风险。
这种分析逻辑值得关注。
GWAS 告诉我们的通常是：“这个基因组区域与疾病风险相关。”
单细胞 eQTL 则有机会继续向下追问：
|
这个风险变异究竟在哪一种细胞中影响了哪个基因？ |
这是从统计关联走向功能机制过程中非常重要的一步。
换一个队列、换一批祖源，这些结果还能站住吗？
单一队列发现的结果，需要面对一个很现实的问题：能否重复。
因此研究团队又分析了 CLUES 和 ImmVar 的独立单细胞数据。这套数据包含约 120 万个 PBMC，覆盖 SLE 患者和健康对照，并包含欧洲祖源和亚洲祖源人群。
由于样本量较小，这部分研究只能重点分析 cis eQTL。
结果中，cis eQTL 对基因表达遗传力的中位贡献约为 4%，与 OneK1K 的 3% 接近；但细胞类型特异性达到 63%，高于 OneK1K 中对应的约 34%。
独立队列由于统计功效有限，只发现了 4 个达到严格显著性的 cs-eGenes，但其中：
|
3 个与 OneK1K 中的 cs-eGenes 重叠 |
更大范围来看，在 OneK1K 中识别出的 183 个 cs-eGenes 中，有 36 个在 CLUES 中达到 P<0.05；而其余 9,705 个基因中只有 57 个达到这一标准。
研究因此认为，eQTL 的细胞类型特异性并不是某一个数据集偶然产生的现象，而是在不同祖源、不同健康状态和不同单细胞队列之间具有一定稳定性。
但不要因此认为 bulk eQTL“已经过时”
|
是不是以后所有 eQTL 研究都应该改成单细胞？ |
答案显然没有这么简单。
CIGMA 本身也有明确局限。
首先，它使用细胞类型 pseudobulk 数据，也就是先把同一个人的同类细胞进行聚合，因此依然会忽略一个细胞类型内部更细的细胞状态差异。
一个 CD4 T 细胞并不是永远处在同一种状态。静息、激活、感染、炎症刺激乃至不同发育阶段，都可能改变遗传变异的调控作用。
其次，CIGMA 的核心目标是估计一组 SNP 共同解释的遗传方差，而不是精准识别每一个因果 SNP。因此它的参数估计相对更噪声化，而且目前不能像共定位分析（colocalization）那样直接判断某个 GWAS 信号和某个 eQTL 信号是否由同一因果变异驱动。
此外，研究没有系统分析 SLE 患者与健康人之间 eQTL 特异性的差异，这恰恰可能是未来非常重要的问题。
所以，这项研究并不是在否定 bulk RNA-seq，而是在提醒我们：
|
不同研究设计看到的是遗传调控的不同部分。 |
如果遗传效应会随细胞改变，我们应该怎样重新理解 GWAS？
这篇研究最值得关注的地方，也许不是“发现了 193 个显著 cs-eGenes”。
数字本身并不是重点。
更重要的是，它提出了一种不同的遗传学视角。
我们习惯于把一个变异描述为“提高某基因表达”或“降低某基因表达”。但越来越多的数据提示，这种表述可能缺少一个条件：
|
在哪一种细胞里？ |
甚至还可以继续关注：
在什么细胞状态下？
受到什么环境刺激时？
处于什么发育阶段？
疾病发生之前还是之后？
遗传变异本身没有改变，但它所处的调控环境一直在变化。
从这个角度看，复杂疾病之所以“复杂”，可能不只是因为参与的基因很多，也因为同一个遗传变异的功能后果依赖于它发生作用的生物学背景。
过去的大规模 GWAS 帮助我们回答了“基因组哪里与疾病有关”。
eQTL 研究进一步追问“这些变异影响了哪些基因”。
而单细胞遗传调控研究正在把问题继续推进一步：
|
这些遗传效应，究竟发生在哪一种细胞中？ |
当这个问题能够被更准确地回答时，我们对复杂疾病遗传机制的理解，也许才会从“找到关联”进一步走向“解释关联”。
而这可能正是未来大规模单细胞基因组学最值得期待的价值之一。
参考文献
