Cell | 免疫耗竭与自身免疫竟共享同一套干性程序：LEF1⁺ T细胞带来的新范式

过去我们以为“TCF1高”就够了，现在看并不够

在慢性感染、肿瘤和自身免疫研究中，TCF1（T cell factor 1）长期被认为是“干样”或“祖细胞样”CD8 T细胞的重要标志。许多研究把TCF1高表达细胞视为维持长期免疫反应的细胞池。

但这项研究提出一个更细的问题：TCF1高表达细胞真的都是“干细胞样”吗？

研究人员首先在1型糖尿病（type 1 diabetes, T1D）小鼠模型中观察自身反应性CD8 T细胞。该模型中，识别胰岛β细胞相关抗原IGRP（islet-specific glucose-6-phosphatase catalytic subunit-related protein）的CD8 T细胞会在胰腺淋巴结（pancreatic lymph node, pLN）被激活，并最终导致β细胞破坏。

他们发现，TCF1高表达群体并不均一。其中只有一小群细胞表达LEF1（lymphoid enhancer-binding factor 1）。这群细胞被定义为干T细胞（stem T cell, TSC），表型为 LEF1⁺ TCF1^hi；另一群虽然也维持TCF1高表达，却不表达LEF1，被定义为祖细胞T细胞（progenitor T cell, TPRO），表型为 LEF1⁻ TCF1^hi；进一步分化后的细胞为 TCF1^lo 的分化T细胞（differentiated T cell, TDIFF）。

这个层级可以简化为：

TSC → TPRO → TDIFF

值得注意的是，TSC和TPRO都属于TCF1高表达细胞，但功能差异很大。换句话说，TCF1像是一个宽泛门牌号，而LEF1更像是进入“自我更新核心区”的通行证。

500个细胞，足以看出谁能真正“续航”

为了验证LEF1⁺细胞是否真的具有干性（stemness），研究人员进行了过继转移实验（adoptive transfer）。

他们先在一级宿主体内生成TSC和TPRO，再从胰腺淋巴结中分选这两类细胞，转移到二级宿主中。关键设计是：转移细胞数量非常少，部分实验中每只受体小鼠只接受 500个TSC或500个TPRO。

结果显示：LEF1⁺ TSC能够在二级宿主体内持续存在，自我更新，并重新生成TSC、TPRO和TDIFF三类细胞，还能导致胰腺浸润。相反，LEF1⁻ TPRO不能有效持续存在，也不能产生进入胰腺的后代细胞。在NOD/SCID受体小鼠中，接受TSC的小鼠更快发生1型糖尿病，而接受TPRO的小鼠明显不易发病，差异达到统计学显著水平，p值为0.0006。

这组实验的含义并不复杂：能不能长期维持疾病相关T细胞反应，关键不在于“TCF1高不高”，而在于是否处在LEF1⁺ TSC状态。

这也提示我们重新思考慢性炎症。许多疾病并不是因为效应细胞一次性过度活跃，而是因为背后存在一个不断补充效应细胞的“上游细胞池”。

删除LEF1后，疾病推动力明显下降

标志物和因果作用之间有重要区别。LEF1只是TSC的标签，还是维持TSC所必需的因子？

研究人员用CRISPR/Cas9基因编辑直接敲除TSC中的Lef1。结果显示，Lef1缺失的TSC诱导1型糖尿病的速度明显变慢，p值为0.0047。在竞争性转移实验中，研究人员把Lef1缺失TSC和对照TSC按50:50混合后转移到同一受体内，18–21天后，Lef1缺失细胞在胰腺淋巴结和胰腺中的回收量都明显低于对照，p值分别为0.0162和0.0460。

更进一步，当研究人员同时敲除Lef1和Tcf7时，T细胞持续存在和分化几乎完全丧失，并能阻止糖尿病发生。

这说明LEF1不是旁观者。它参与维持TSC的持续存在、自我更新和疾病驱动能力。一个有意思的细节是，单独删除Lef1并不影响CD62L表达，也不明显影响T细胞进入淋巴结，提示LEF1的作用并不是简单改变“细胞去哪儿”，而更可能影响“细胞处于什么命运状态”。

最剧烈的变化，发生在“干性丢失”的第一步

研究人员随后用单细胞多组学（single-cell multiome）同时检测转录组（scRNA-seq）和染色质可及性（scATAC-seq）。他们从约150只NOD小鼠中分选IGRP特异性CD8 T细胞，质控后获得 632个单细胞，并识别出TSC、TPRO和TDIFF三个主要群体。

数据中最值得玩味的是两个数字。

从TSC到TPRO，出现 277个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）；但从TPRO到TDIFF，只有 39个差异表达基因。

在染色质层面差异更明显：TSC到TPRO有 1150个差异可及区域（differentially accessible regions, DARs），而TPRO到TDIFF只有 28个DARs。

这意味着什么？

表面上看，TPRO到TDIFF似乎是“终末分化”的显著步骤，因为TCF1从高变低；但从分子程序看，真正的大转折发生在更早的TSC到TPRO阶段，也就是LEF1丢失的时候。细胞可能在外观上还保持TCF1高表达，却已经在表观遗传层面失去了干性程序。

这提醒我们：在免疫细胞命运研究中，单个经典标志物可能滞后于真正的命运转折。细胞身份并不总是由最显眼的表面变化决定，有时染色质状态已经提前改写了未来。

LEF1不是单独工作，它牵动了一整套干性网络

研究人员进一步使用CUT&RUN技术分析LEF1在基因组上的结合位点。他们识别出约 27000个LEF1共识结合峰。把这些数据与单细胞多组学结果整合后发现，LEF1结合了TSC与TPRO之间超过75%的差异表达基因，对应 216个LEF1结合的差异表达基因；同时，1465个LEF1结合峰与差异可及区域重叠。大约一半LEF1结合峰在TSC向TPRO转变过程中发生可及性变化。

这组结果支持一个推断：LEF1可能一方面激活TSC相关基因程序，例如Foxp1、Satb1等；另一方面抑制TPRO相关程序，例如Itga4等。也就是说，LEF1不只是打开某些“干性基因”，还可能帮助TSC暂时关住通往分化和迁移的门。

更有意思的是，TSC富集了胚胎干细胞（embryonic stem cell）和神经干细胞（neural stem cell）相关基因程序。WNT/β-catenin通路和Notch信号（Notch signaling）在TSC中尤其突出。WNT/β-catenin基因集在TSC中的富集显著，统计学检验p值小于2.2×10^-16；成像流式结果还显示，TSC中β-catenin更倾向于进入细胞核，这符合WNT信号活跃的特征。

Notch信号也不是简单“相关”。当研究人员敲除Notch1和Notch2，TSC数量明显下降；在胰腺淋巴结和胰腺中回收的8.3 T细胞均显著减少，p值为0.001；TSC绝对数量下降的p值为0.027。另一种抑制Notch信号的方式——表达显性负性MAML（dominant-negative MAML, DNMAML）——同样导致TSC池减少。

这些结果共同指向一个概念：慢性疾病中的TSC并不是孤立维持干性，而是借用了许多经典干细胞系统中的模块，包括WNT、Notch、空间定位和微环境信号。

免疫细胞也需要“生态位”：位置决定命运

干细胞研究中有一个重要概念叫生态位（niche）：干细胞不是只靠自身基因程序维持状态，它还依赖周围环境提供信号。肠道、皮肤、骨髓等组织中的成体干细胞（adult somatic stem cell）都受生态位调控。

这项研究把类似思路引入慢性T细胞反应。TSC、TPRO和TDIFF表达不同的趋化因子受体、整合素（integrin）和迁移相关分子。TSC偏向表达Sell、Ccr7、Itgb7；TPRO表达Cxcr3、Itga4、Itgb2、Itgb1；TDIFF表达Cxcr6和Ccl4。

其中ITGA4尤其关键。ITGA4与ITGB1组成VLA-4。研究显示，ITGA4在TSC向TPRO分化过程中上调。研究人员用抗ITGA4单克隆抗体（anti-ITGA4 monoclonal antibody）处理小鼠，结果完全阻止了1型糖尿病发生；该实验每组7只小鼠，p值为0.0014。与此同时，胰腺中的T细胞浸润显著减少，p值为0.0028。进一步用CRISPR敲除Itga4，也阻断了TDIFF分化并减少胰腺浸润。

慢性自身免疫反应不仅是“细胞是否被激活”的问题，也是“细胞是否到达合适位置、接收合适环境信号”的问题。阻断迁移和空间定位，可能切断疾病持续推进的路径。

自身免疫和慢性感染，竟然共享同一套“干性核心程序”

如果LEF1⁺ TSC只存在于1型糖尿病模型中，它的意义会有限。研究人员因此转向慢性病毒感染模型：LCMV clone 13（LCMV-cl13）。

在慢性感染4周后，GP33特异性CD8 T细胞同样形成LEF1⁺ TCF1^hi TSC、LEF1⁻ TCF1^hi TPRO和TCF1^lo TDIFF三个层级。该现象在NOD小鼠和B6小鼠中都能观察到，说明并非特定遗传背景的偶然现象。

单细胞多组学分析进一步获得 4128个质控后GP33特异性CD8 T细胞，识别出5个主要细胞群，包括TSC、TPRO和3类终末分化TDIFF亚群。更关键的是，把自身免疫TSC的基因特征投射到慢性感染数据中，自身免疫TSC落入LCMV-cl13感染中的LEF1⁺ TSC簇。

研究人员随后整合自身免疫和慢性感染两个数据集，发现两种疾病背景下的TSC高度重叠，并识别出 117个共享的TSC核心差异基因。这些基因在两个背景中的调控方向一致，没有一个出现方向相反。上调基因包括Lef1、Wnt5b、Il6ra等，下调基因包括Ikzf2、Zeb2、Il18r、Itga4/Itgb1等。

这说明，自身免疫和慢性感染虽然病理后果不同：一个持续攻击自身组织，一个进入功能低反应的耗竭状态；但它们维持长期T细胞反应的上游逻辑可能相似：都依赖LEF1⁺ TSC所代表的干性核心程序。

这项研究改变了什么问题？

这项研究最值得关注的不是“LEF1是一个新标志物”，而是三层认识变化。

第一，TCF1高表达群体需要进一步拆分。LEF1⁺ TCF1^hi才代表真正具有自我更新能力的TSC，而LEF1⁻ TCF1^hi更接近已经失去干性的祖细胞状态。

第二，慢性T细胞反应的关键转折可能早于终末分化。TSC到TPRO的转变伴随大量转录和染色质变化；相比之下，TPRO到TDIFF虽然表型上更“分化”，但分子层面的变化反而较小。

第三，慢性疾病中的T细胞干性不是孤立由转录因子决定。它由LEF1、WNT/β-catenin、Notch信号、整合素、迁移路径和局部生态位共同塑造。

但局限性也不容忽视。该研究主要基于小鼠1型糖尿病模型和LCMV慢性感染模型。它为人类自身免疫病、慢性感染甚至肿瘤免疫提供了重要假设，但尚不能直接等同于临床治疗方案。研究本身也指出，未来需要用更高分辨率的空间单细胞分析明确这些TSC所在的具体微环境，并验证人类慢性疾病中是否存在相同机制。

真正的问题也许是：当我们想要治疗慢性免疫疾病时，应该只盯着末端效应细胞，还是应该更早地追问——是谁在持续补充它们？

如果答案是LEF1⁺ TSC，那么免疫干预的靶点可能要从“扑灭火焰”，转向“切断燃料供应”。