Science | 进化负责划定底线，AI负责探索未知：蛋白质设计的新范式

为什么设计一个基因编辑器，比预测它的结构难得多？

蛋白质结构预测解决的问题是：给定一条氨基酸序列，它可能折叠成什么形状。

蛋白质设计面对的是相反的问题：给定一个期望结构和功能，应该写出怎样的氨基酸序列？

这被称为逆折叠（inverse folding）。理论上，只要知道目标蛋白质的三维骨架，模型就可以寻找能够稳定形成这一结构的序列。但对于RNA引导核酸酶而言，“折叠正确”远远不等于“能够工作”。

一个核酸酶完成DNA切割，需要连续经历多个步骤：识别特定DNA信号、结合向导RNA、打开双链DNA、形成RNA–DNA杂交结构、重排蛋白质构象，最后将待切割DNA送入催化中心。任何一个环节受损，蛋白质都可能看起来结构完整，却没有编辑活性。

更困难的是，这类酶通常由多个结构域组成。某些氨基酸负责维持骨架，某些参与催化，另一些只在特定构象中短暂接触RNA或DNA。静态结构未必能够显示所有关键相互作用。

因此，设计核酸酶并不是简单地“重新写一条能折叠的序列”，而是在一个巨大的序列空间中，同时满足结构、识别、动力学和催化等多重约束。

TnpB：比Cas9更小，也更接近基因编辑系统的“原型”

研究团队选择的设计对象是TnpB。它是一类由转座元件编码的微型RNA引导核酸酶，被认为是CRISPR-Cas12核酸酶的进化祖先之一。

TnpB具有两个重要特点。

首先，它足够小。研究中使用的ISDra2 TnpB蛋白约为46千道尔顿，与之结合的RNA–DNA复合物约为49千道尔顿。相比体积较大的Cas9，紧凑的TnpB更适合受到递送容量限制的应用，尤其是病毒载体介导的体内或植物基因编辑。

其次，TnpB已经具备可编程DNA识别和切割能力。它依赖向导RNA识别靶序列，并通过转座子相关基序（transposon-associated motif，TAM）启动切割，其作用类似Cas9所需的前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）。

它像一个已经能够运转、但结构相对简洁的原型系统：复杂度足以检验设计方法，体积又没有大到难以处理。

第一步并不成功：AI能保住骨架，却会改坏关键接触位点

研究人员首先使用ESM逆折叠模型ESM-IF1，根据ISDra2 TnpB的结构生成新序列。

结果显示，模型确实掌握了部分重要规律。生成序列能够重新折叠为预期的TnpB结构，并保留RuvC催化结构域中的DED催化三联体。更引人注意的是，这些序列与天然ISDra2 TnpB的相同性只有约50%至60%，在系统发育树上形成了区别于天然TnpB的独立分支。

这意味着模型没有只在天然序列附近进行小幅修改，而是进入了更远的序列区域。

问题也随之出现。模型改变了K76、F77和T123等参与TAM识别的位点，也替换了一些与向导RNA接触的残基。换言之，AI知道怎样维持蛋白质骨架和催化中心，却不完全知道哪些核酸接触必须保留。

这揭示了蛋白质生成模型的一个核心局限：结构正确只能证明蛋白质可能存在，不能证明它能够完成复杂功能。

研究团队没有锁死整个活性中心，而是让进化数据告诉模型“哪些位置不能乱动”

最直接的解决办法，是把所有与RNA或DNA接触的氨基酸固定下来，只让模型设计其他区域。

但TnpB与核酸的接触界面非常大。若将某一距离范围内的残基全部锁定，可供重新设计的空间会大幅缩小。更何况，冷冻电镜结构捕捉到的只是若干稳定状态，一些瞬时接触可能根本没有被观察到。

研究人员因此引入了两类进化信息。

第一类是位置保守性（positional conservation）。如果某个氨基酸在大量天然TnpB中高度保守，它很可能承担重要功能。

第二类是共进化耦合（coevolutionary coupling）。如果蛋白质中的某个位点与RNA或DNA中的某个碱基长期协同变化，说明二者之间可能存在功能联系。

研究团队利用天然TnpB序列以及与其配对的RNA、DNA数据，计算每个蛋白质位点的保守程度和蛋白质—核酸耦合强度，再通过阈值决定哪些野生型残基必须保留。

这相当于给AI设置了两层边界：结构模型负责探索新的序列，进化信息负责保护经过长期自然选择验证的关键关系。

值得注意的是，这一策略并非要求模型完全复制自然。它保留的是功能约束，而不是天然序列本身。

一个蛋白质，两种“可改造性”：识别模块比催化模块更脆弱

为了提高筛选效率，研究人员没有始终把TnpB当作一个不可拆分的整体，而是将其分为两个功能模块。

REC叶（recognition lobe）主要参与DNA识别；NUC叶（nuclease lobe）承担RNA结合和催化相关功能。研究人员分别生成两个模块的新序列，再将AI设计模块与天然模块组合测试。

结果显示，两部分对序列变化的容忍度明显不同。

在仅使用位置保守性约束的实验中，16个AI生成的NUC叶变体中有13个保留活性，部分活性高于野生型；而REC叶只有1个设计变体在与野生型NUC叶组合后仍然有效。

这种不对称并不难理解。REC叶需要完成TAM搜索和DNA序列识别，空间排列和分子接触可能具有更严格的要求。NUC叶虽然承担催化功能，但其中更多位置可能允许不同氨基酸以不同方式实现相近作用。

这也提醒我们：所谓“蛋白质可设计性”并不是一个统一属性。同一蛋白质中的不同模块，可能拥有完全不同的序列自由度。

1980种组合中，466种能够工作

在同时加入位置保守性和共进化耦合约束后，研究团队进一步生成了44种REC叶和45种NUC叶，并对所有可能组合进行测试。

44 × 45 = 1980

共得到1980种完整TnpB设计

研究人员构建了细菌高通量筛选体系：如果TnpB能够切割携带ccdB毒素基因的质粒，细菌就能存活；如果TnpB失去活性，毒素表达会抑制细胞生长。通过比较选择条件和非选择条件下各设计序列的丰度，可以同时估计大量变体的切割能力。

1980种组合中，有466种在细菌实验中显示出可检测的富集，占全部设计的24%；其中约8%的活性超过天然ISDra2 TnpB。研究团队最终筛选出9个兼具活性与序列差异的候选变体，命名为SynTnpB-v1至v9。

24%的成功率意味着什么？

如果随机改变一个复杂酶的大量氨基酸，绝大多数结果通常是功能下降或完全失活。这里测试的并不是少量点突变，而是含有大量非天然替换的模块组合。四分之一设计仍能工作，说明模型确实捕捉到了部分超越单一序列的功能规则。

但反过来看，仍有约四分之三的组合没有表现出可检测活性。AI设计尚未把蛋白质工程变成可直接求解的问题，它只是显著提高了在巨大搜索空间中找到有效答案的概率。

进入人类细胞后，两个AI变体把编辑效率提高到了46%和50%

细菌筛选只能证明核酸酶具有基本切割能力。要判断其是否具备基因编辑价值，还必须在真核细胞中测试。

研究人员首先在HEK293T人胚肾细胞中进行蓝色荧光蛋白基因（blue fluorescent protein，BFP）敲除实验。天然ISDra2 TnpB的平均编辑效率为28%。

BFP基因敲除实验

v1：46%　　v5：50%

均显著高于野生型的28%

多数SynTnpB变体的效率位于23%至32%之间，与野生型相近。v1和v5则分别达到46%和50%，且与野生型相比差异均具有统计学意义。

随后，研究人员检测了RUNX1、NIBAN1、EMX1和AGBL1四个人类内源性位点。

v1在这四个位点的插入缺失突变（insertion and deletion，indel）比例依次为21%、28%、26%和26%；v5依次为35%、24%、21%和20%。在EMX1位点，野生型编辑效率只有7%，v1和v5分别达到26%和21%，约为野生型的3.8倍和3.1倍。

这一结果很重要，因为它说明性能提升并不限于人工构建的报告基因。部分AI设计蛋白质能够识别不同内源性靶点，并在真实染色质环境中完成编辑。

不过，活性提高并不自动等于性能全面优化。

全基因组脱靶检测显示，v1的特异性与野生型大致相当，但v5和v7出现了更多可检测脱靶位点。所有变体仍保留经典的TTGAT TAM偏好，也没有扩展为不受靶序列限制的通用编辑器。

一个工具是否更好，不能只看“切得更多”，还要看它在哪里切、切错多少，以及不同细胞环境中的表现是否稳定。

v7只保留77%的序列相同性，却维持了完整的构象运动

在多个候选变体中，v7提供了最值得分析的结构样本。

v7在RUNX1位点的编辑效率达到44%。除去被固定的无序C端后，它与野生型TnpB的序列相同性仅为77%；其中REC叶为83%，NUC叶为72%。整条蛋白质中有85个位点由AI生成，约占四分之一。

如此多的变化为什么没有破坏功能？

研究团队利用冷冻电子显微镜（cryo-electron microscopy，cryo-EM），以2.8埃分辨率解析了v7与RNA、DNA形成的三元复合物，并捕捉到TAM结合状态和R环状态（R-loop state）。

结构显示，AI引入的多个带正电残基增强了NUC叶表面的正电势，从而稳定带负电的RNA骨架；另一些新残基在RNA–DNA杂交双链周围建立了新的静电作用和氢键网络。

更关键的是，新序列没有把蛋白质固定成一个静态结构。随着RNA–DNA杂交链延伸，盖状结构域和桥螺旋仍然能够发生与天然TnpB相似的构象变化。一个主要由AI生成残基组成的螺旋片段，依旧保留了促进杂交链形成所需的弯折运动。

换句话说，模型设计出的不只是“长得像TnpB”的蛋白质，而是能够沿着相似构象路径运动的分子机器。

研究还观察到一种此前未报道的TAM结合中间状态：蛋白质已经结合DNA，但向导RNA与靶DNA之间只形成了一个种子区碱基对。这可能代表核酸酶从识别靶标到形成完整R环过程中的瞬时阶段。

这项研究改变的，可能是蛋白质工程的提问方式

传统蛋白质工程常问：怎样在天然蛋白质基础上增加几个有利突变？

这项研究提出了另一个问题：在保留必要功能约束的前提下，一种蛋白质可以与自然版本不同到什么程度？

过去一些序列语言模型生成的核酸酶，其DNA结合结构域与天然同源蛋白的相同性仍超过99%。而这项工作设计出的DNA和RNA相互作用模块，与最接近的天然对应序列相同性分别只有83%和72%。

这不是彻底的从头设计（de novo design）。SynTnpB仍以天然TnpB结构为出发点，也依赖天然序列提供进化约束。但它已经超越了围绕单个野生型进行局部优化的范式。

其中更具普适性的部分，是“结构探索加进化护栏”的设计框架：结构模型扩大可搜索空间，保守性信息保护关键位点，共进化信息保留跨分子相互作用，再通过模块化实验筛选识别不同区域的耐受性。

这种方法未来或许可以用于其他多结构域酶、核酸结合蛋白，以及需要经历多个构象状态的分子系统。但论文也明确隐含了一个前提：目标蛋白质及其配对RNA、DNA需要在基因组数据库中具有足够丰富、均衡的序列代表性。缺少高质量进化数据时，这套“护栏”可能并不可靠。

当AI能够设计自然界未提供的序列，我们还应该追问什么？

SynTnpB目前仍处于方法学验证阶段。研究主要在细菌、培养的人类细胞和拟南芥原生质体中完成，尚未证明其在动物体内递送、长期安全性、免疫原性或治疗场景中的可行性。部分高活性变体脱靶位点增多，也表明活性、特异性和可递送性仍需联合优化。

但这项研究已经给出一个清晰信号：进化不再只是蛋白质设计的素材库，也可以成为生成模型的约束语言。

自然选择探索了数十亿年的蛋白质空间，却只保留了适合特定生态环境的少量答案。人工智能的价值或许不在于重复这些答案，而在于学习其中的结构与功能规则，然后进入进化没有充分探索、但物理上允许存在的区域。

下一代基因编辑器，可能不再有一个可以在自然界中找到的“祖先原型”。到那时，我们评价一个蛋白质的方式也会发生变化：重要的不只是它来自哪里，而是它是否能够稳定、可控、准确地完成我们赋予它的任务。