新抗原通常来源于肿瘤细胞的非同义体细胞突变（nonsynonymous somatic mutation）。突变产生的异常多肽若能被人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）呈递，就可能被TCR识别。
然而，仅靠突变预测并不能证明一个新抗原确实被表达、呈递和识别；仅靠TCR测序，也无法得知某个T细胞克隆在追踪什么目标。传统单细胞测序还会在组织解离过程中丢失空间信息：两个细胞即使在数据中同时出现，也可能在原组织中相距甚远。
Slide-GoTags的处理对象是20微米厚的冷冻组织切片。研究人员先为空间位置加上条形码，再进行基于液滴的单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing，snRNA-seq）。在同一份互补DNA（cDNA）文库中，他们又定向富集突变位点和TCR的互补决定区3（complementarity-determining region 3，CDR3），并借助长读长测序恢复突变状态及较完整的TCR序列。
共享的细胞条形码最终把四层信息连接起来：这个细胞是谁、表达什么、携带哪种突变、位于组织何处。
研究人员首先采用一个答案相对明确的小鼠结直肠癌模型。部分MC38肿瘤细胞被设计为表达SIINFEKL抗原，而输入小鼠体内的OT-I T细胞具有识别该抗原的已知TCR。
Slide-GoTags获得了2938个高质量细胞核，其中1957个成功完成空间定位，比例为67%。在185个根据基因表达鉴定的T细胞中，其TCRα链和TCRβ链的检出数量，分别是常规10x Genomics单细胞V(D)J测序的2.6倍和3.6倍；在人黑色素瘤样本中，相应提升达到11.8倍和13.6倍。
在能够检出TCR的T细胞中，OT-I克隆占64%。研究人员还在70个表达SIINFEKL转录本的肿瘤细胞中，通过靶向基因分型检出了其中61%。基因表达与靶向分型结果具有较强一致性，相关指标为φ=0.80、F1=0.76。也就是说，这套方法能够在保留组织坐标的同时，把已知抗原与对应TCR重新放回同一张图上。
这一步很重要。只有先找回一组已知答案，才能进一步判断：当抗原与TCR关系未知时，空间邻近能否帮助研究人员缩小候选范围。
接下来，研究人员分析了接受抗PD-1或抗CTLA-4治疗的小鼠MC38肿瘤。两个治疗组各有3只小鼠；共检测25992个细胞核，其中15250个完成空间定位。
在7种已知MC38新抗原中，Rpl18 p.Q125R的检测效果最好：76%的已表达Rpl18转录本完成基因分型，66%的肿瘤细胞被赋予该突变状态；所有检出TCR中，11%可归为Rpl18特异性TCR。
抗PD-1组的平均T细胞浸润比例为5.6%，高于抗CTLA-4组的0.9%和未治疗组的0.6%。但该比较的P值为0.1，因此更适合表述为“存在升高趋势”，而不是已经获得统计学意义上的确定差异。这个细节提醒我们：视觉上明显的差距，并不必然等于证据已经充分。
更有信息量的是空间关系。在两只接受抗PD-1治疗的小鼠中，Rpl18特异性T细胞与表达Rpl18 p.Q125R的肿瘤细胞显著共定位；非Rpl18特异性T细胞则没有出现同样模式。距离突变肿瘤细胞越近，Rpl18特异性T细胞的增殖评分越高，相关检验P值为0.01；其他T细胞的对应P值为0.84。
这说明，抗肿瘤免疫不能只用“有多少T细胞”来描述。T细胞是否靠近正确的靶细胞，以及靠近后处于什么功能状态，同样关键。
Rpl18特异性T细胞表现出效应和耗竭相关转录特征。尤其当肿瘤细胞高表达Rpl18新抗原时，Rpl18特异性CD8⁺ T细胞中同时表达TIM3和LAG3的比例进一步升高，P值为0.031。
T细胞耗竭（T cell exhaustion）常被理解为免疫系统失去战斗力。但在肿瘤组织中，耗竭标志也可能记录长期、持续的抗原刺激。一个T细胞若从未识别肿瘤抗原，未必会形成同样的转录状态。
因此，这项研究呈现出一组值得思考的连续关系：新抗原表达越充分，特异性T细胞越可能被持续刺激；刺激可以伴随增殖和效应反应，也可能推动耗竭与抑制通路形成。免疫激活和免疫制动，并不是互相排斥的两个阶段，它们可能在同一局部区域同时发生。
在一个既往已有TCR功能验证数据的透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）样本中，研究人员分析了4张组织切片，共获得27518个细胞核，其中14914个完成空间定位。
既往实验已确定该样本中有35种肿瘤特异性TCR，其中11种识别患者个体化新抗原NSUN5 p.Q18K。Slide-GoTags在肿瘤细胞中检出66个表达该突变的细胞核，并获得345条TCRα链和485条TCRβ链。
不同切片呈现出明显异质性。NSUN5特异性TCR在切片A中的丰度，是切片B和切片C的5.8～6.4倍。更关键的是，NSUN5特异性T细胞与NSUN5突变肿瘤细胞显著共定位，标准化混合评分（normalized mixing score，NMS）为2.26，P<0.001；同样的T细胞并未与NSUN5野生型肿瘤细胞形成对应共定位。
在抗原与T细胞高度重叠的区域，高亲和力NSUN5特异性T细胞显著富集，优势比（odds ratio，OR）为5.40，P=5.82×10⁻³，并表现出更高的细胞毒性评分。该区域的肿瘤细胞还富集干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）反应、HLAⅠ类和Ⅱ类分子及抗原呈递相关信号。
研究人员把这种区域称为免疫原性生态位（immunogenicity niche）：这里不只是T细胞多，而是同时出现了新抗原表达、特异性TCR聚集、IFN反应和抗原呈递增强。
研究进一步扩展到9个人类肿瘤，包括透明细胞肾癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤（glioblastoma，GB）和卵巢癌。研究人员共分析130866个细胞核，其中78651个完成空间定位。
每个样本最初有中位数91个候选突变，经过HLA结合预测、转录本位置和表达量等条件筛选后，最终选择59个潜在新抗原突变进行靶向分型，每个样本中位数为6个。研究共识别出1856个表达至少一种预测新抗原转录本的恶性细胞，以及1053个检出TCRα链或TCRβ链的T细胞。
黑色素瘤和透明细胞肾癌更倾向于形成免疫原性生态位，而胶质母细胞瘤和卵巢癌相对缺乏这类区域。生态位丰富区中，扩增的TCRβ克隆比例显著升高，P值为0.016；TCRα的对应P值为0.25，并未达到统计学显著。
跨癌种分析共发现10条与新抗原表达肿瘤细胞空间相关的TCRα或TCRβ链，其中2条获得功能实验验证，3条在免疫原性生态位中显著富集。研究人员还在小鼠肿瘤内注射IFN-γ，结果显示抗原特异性OT-I T细胞浸润增加，P值为0.03。这为“IFN丰富区域可能促进特异性T细胞募集”提供了实验支持。
由此看来，“热肿瘤”（hot tumor）与“冷肿瘤”（cold tumor）的差异，未必只是整块肿瘤中免疫细胞总量不同。一个肿瘤内部可以同时包含免疫活跃区和免疫沉默区；决定疗效的，可能是某些局部区域是否形成了抗原、T细胞、抗原呈递细胞和细胞因子相互支持的网络。
研究人员进一步利用NetMHCpan预测突变肽与HLAⅠ类分子的结合能力，在9个肿瘤中识别出32个预测强结合肽和17个弱结合肽。
强结合新抗原富集区域中，CD8⁺ T细胞比例更高，OR为1.63，校正后P值为3.7×10⁻⁴；弱结合区域则更富集具有抗炎和免疫抑制特征的M2样巨噬细胞，OR为0.59，校正后P值为1.1×10⁻⁵。靠近强结合新抗原肿瘤细胞的CD8⁺ T细胞，还表现出更高的耗竭或应激评分，P值为0.045。
这组结果并不能证明HLA结合预测分数单独决定了局部免疫环境，但它提示：不同突变亚克隆并非只是基因组上的差异，它们可能通过抗原呈递能力，参与塑造周围细胞的组成和状态。
Slide-GoTags提供的是空间关联证据，而不是对TCR特异性的最终证明。两个细胞彼此靠近，可能意味着形成免疫突触（immunological synapse），也可能只是因为它们共同聚集在细胞密度较高的区域。一种肿瘤细胞还可能同时表达多个新抗原，附近也可能存在多个TCR克隆，因此空间关系仍需结合四聚体检测、TCR重构和体外功能实验验证。
技术本身也受到RNA表达量限制。低表达转录本、靠近转录本3′端的突变以及转录本丢失（transcript dropout）都可能降低基因分型效率。RNA中的突变等位基因比例还可能受到等位基因不平衡、表观遗传调控和转录后加工影响，不能简单等同于DNA层面的变异比例。单核测序会损失部分细胞质RNA，因此稀有TCR克隆也可能被漏检。
此外，跨癌种结论目前来自9个肿瘤样本，适合提出机制假设和技术可行性证据，尚不足以估计不同癌种中免疫原性生态位的稳定发生率，更不能直接预测患者疗效。
但这项研究推动了一个重要转变：评估抗肿瘤免疫时，不再只问“有哪些突变”和“有哪些T细胞”，而是进一步追问——表达某个新抗原的肿瘤细胞在哪里？可能识别它的T细胞在哪里？两者相遇之后，周围的免疫生态发生了什么变化？
当基因型、TCR、细胞状态和空间坐标被放进同一分析框架，肿瘤免疫学研究开始从成分统计走向关系解析。未来，它可能帮助研究人员优先筛选值得验证的肿瘤反应性TCR、定位免疫耐药形成的区域，并为个体化T细胞治疗和新抗原疫苗提供更具空间依据的候选靶点。
而最值得继续关注的问题或许是：决定免疫治疗成败的，究竟是肿瘤中拥有多少免疫细胞，还是这些细胞能否在正确的位置、识别正确的抗原，并在抑制信号占据优势之前形成有效协作？
参考文献
