约2万个蛋白编码基因，为什么装不下人类蛋白质组？
人类大约有2万个蛋白质编码基因（protein-coding genes），但细胞中实际存在的蛋白质状态远远不止2万种。
原因并不陌生。一个基因可以发生可变剪接（alternative splicing），同一种蛋白质可以经历不同的翻译后修饰（post-translational modification, PTM）；父母来源的两个等位基因可能同时表达；体细胞突变（somatic mutation）还会继续制造新的序列差异。
这项研究进一步关注了另一个长期被忽视的来源：转录和翻译本身并不是百分之百准确的。
特别是在翻译过程中，核糖体（ribosome）读取密码子、转运RNA（tRNA）携带氨基酸、氨酰-tRNA合成酶进行识别与装载，这一系列过程都有极低概率发生偏差。结果是：DNA和RNA可能指向一种氨基酸，最终合成的某些蛋白分子却在特定位置出现了另一种氨基酸。
这种变化不会像生殖系突变那样遗传给下一代，却可以直接制造新的蛋白质型（proteoform）。
问题在于：过去很难在复杂的人体蛋白质组中，大规模、可靠地把这些少量异常蛋白分子找出来。
这正是这项研究试图解决的问题。研究人员开发了更严格的质谱（mass spectrometry, MS）分析流程，并结合RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq），试图回答两个问题：
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这些氨基酸替换到底有多少？它们究竟来自遗传变异，还是产生于DNA之后？ |
13,910次氨基酸替换：蛋白质并不总按“标准版本”输出
研究基于覆盖29种健康人体组织的大规模蛋白质组和转录组资源进行分析；其中需要明确RNA-seq配对证据的分析实际排除了RNA信息不清晰的肾脏和肝脏样本。
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13,910 次可信定位的氨基酸替换事件 7,215 种独特的单氨基酸替换 |
最终，研究人员检测到 13,910次可信定位的氨基酸替换事件，对应7,215种独特的单氨基酸替换。与此前的分析方法相比，新流程在同一数据中检测到的替换肽数量至少增加了约40%。
这些单氨基酸变体（single amino acid variant, SAAV）并不是同一种来源。
一部分能够在RNA中找到对应的替代序列，例如一个杂合变异（heterozygous variant）既在RNA中出现，也在蛋白质层面出现，这很容易理解——DNA变了，RNA跟着变，蛋白质最终也变了。
真正有意思的是另一类。
质谱检测到了替代氨基酸，但RNA-seq中却找不到相应的替代序列。
最初共有 8,552次这样的替换。进一步要求该位置至少有10条RNA reads明确支持参考序列，同时0条reads支持替代序列后，仍然留下 6,510次氨基酸替换。
它们约占无RNA支持替换的76%。
而且，这些替换并非都低到接近质谱检测极限。它们相对于正常蛋白质型的平均丰度大约为 1∶500。
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同一个人的同一种蛋白质中，可能并不是只有一个严格一致的氨基酸序列。 |
更准确地说，细胞可能同时保存着一个占主导地位的“参考蛋白质型”，以及大量丰度较低的替代蛋白质型。
没有RNA证据，就一定是翻译错误吗？
这是理解该研究最重要的一点：不能简单画等号。
“质谱检测到了替换，而RNA-seq没有检测到”，并不能直接证明这个蛋白质一定来源于翻译错误（mistranslation）。
至少还有两种可能。
RNA-seq覆盖深度不够，低频异常转录本可能刚好没有被捕获；组织内部还可能存在低比例体细胞突变，而取样的RNA并未覆盖到相应细胞。
所以，该研究中的“非遗传变体（non-genetic variants）”很大程度上是一种基于多层证据建立的分类。研究人员认为其中相当一部分很可能来自转录或翻译过程，尤其是翻译错误，但并没有声称每一个都已经完成DNA层面的排除。
这一区分非常重要。
尤其值得注意的是，部分替代肽最初看起来甚至比参考肽更丰富。研究人员检测7对合成肽后发现，其中4对替代肽的质谱离子化效率高出参考肽 10～100倍。进一步估计，离子化效率、低信号噪声和色谱差异等因素，可能让部分非遗传蛋白质型的表观丰度被高估 100～1,000倍。
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“存在”与“有多丰富”是两个不同的问题。 |
研究人员认为，即使进行这种校正，部分替代蛋白质型仍可能达到参考蛋白质的个位数百分比水平，但具体丰度需要更加直接的实验确认。
更意外的是：蛋白质可以到达DNA“一步突变”到不了的位置
如果一个氨基酸变化来自DNA单核苷酸变异，那么原始密码子和新密码子通常只需要改变一个碱基。
研究人员因此计算了每一种氨基酸替换所需的最小密码子突变距离（minimal mutational distance）。
在具有RNA-seq支持的遗传性替换中，5,130个事件里有 5,001个只需要改变一个核苷酸。
但非遗传替换完全不同。
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在5,216个非遗传替换中 1,578个（约30%） 需要至少改变两个核苷酸 119个（约2%） 需要改变三个核苷酸 |
在5,216个非遗传替换中，1,578个，也就是约30%，需要至少改变两个核苷酸；另有119个、约2%，需要改变三个核苷酸。
这一结果的意义相当有趣。
DNA突变探索蛋白质序列空间时，受到遗传密码的限制。如果某个氨基酸A变成氨基酸B必须同时改变两个碱基，那么在遗传进化过程中，中间状态可能首先要经历另一个氨基酸，从而受到选择压力。
但翻译错误不一定需要沿着这条路线。
核糖体或tRNA识别过程一次偏差，就可能直接把另一种氨基酸放进去。
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非遗传变异提供了一条不同于DNA突变的蛋白质序列探索路径。 |
它不能遗传，却可能让细胞短暂“试用”一些遗传突变不容易直接到达的蛋白质状态。
氨基酸不足时，“错译”还会有规律地改变
如果这些现象只是一堆随机噪声，那么不同环境下应该很难出现稳定模式。
但研究人员在氨基酸缺乏实验中看到了相反结果。
色氨酸（tryptophan）缺乏时，W→F替换增加；酪氨酸（tyrosine）缺乏时，Y→F增加；精氨酸（arginine）缺乏时，R→K、R→C、R→H和R→S增加；亮氨酸（leucine）缺乏时，则更容易出现L→F和L→V。
亮氨酸缺乏还伴随明显的M→T替换，而这一变化在非饥饿对照中没有检测到。
更关键的是，研究团队专门处理了“样本制备造成假象”这个问题。例如，一些C→A替换最终被证实很可能来自实验过程中的化学反应；而通过同位素实验，W→D则获得了发生于细胞内部的证据。
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蛋白质错译并不只是均匀散布的随机错误。细胞环境、氨基酸供应，以及翻译系统本身，都可能改变错误发生的方向和概率。 |
最关键的问题：这些“错误蛋白”有功能吗？
发现一种异常蛋白质，并不等于证明它具有生物学功能。
该研究因此继续关注：这些变体有没有显示出被细胞“区别对待”的迹象？
第一条线索来自AlphaMissense。
研究人员利用AlphaMissense预测氨基酸改变对蛋白质功能的潜在扰动程度。结果发现，无论遗传性变体还是非遗传性变体，预测影响越大的替换，在蛋白质组中的丰度往往越低。
遗传变体的相关系数约为 R=-0.44，非遗传变体约为 R=-0.25。
第二条线索来自蛋白酶体（proteasome）。
当研究人员分析使用MG132抑制蛋白酶体的数据后发现，替代蛋白质型整体丰度上升。这提示细胞的蛋白质质量控制系统可能正在优先清除一部分异常蛋白质型。
换句话说，这些变体并不一定只是被动存在，细胞似乎能够对其中一部分进行选择性处理。
还有一条线索更接近功能本身。
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非遗传氨基酸替换出现在 22种蛋白质的85个已注释功能位点 活性位点附近显著富集，P=5×10⁻⁵ 另有392种独特替换存在于163种蛋白质中，并至少在5个不同样本中反复出现 |
研究人员在 22种蛋白质的85个已注释功能位点上发现了非遗传氨基酸替换。更进一步，这些替换在蛋白质活性位点（active site）附近显著富集，P=5×10⁻⁵；但在一般结合位点（binding site）附近没有达到统计学显著性，P=0.06。
与此同时，有 392种独特替换存在于163种蛋白质中，并且至少在5个不同样本中反复出现。
随机错误当然可以发生一次。
但如果同一个位置的同一种改变在不同组织、甚至不同个体中反复出现，那么“纯随机噪声”这一解释就开始变得不够充分。
血红蛋白提供了一组尤其值得关注的线索
血红蛋白（hemoglobin）是这项研究中最引人注意的例子之一。
研究人员在α和β亚基中检测到 227种独特的氨基酸替换，在整个数据集中对应530次替换事件。
其中有 27种替换与既往已经明确研究过的临床相关血红蛋白变体完全一致：20种与氧亲和力升高有关，7种与氧亲和力降低有关。另有73种发生在已知具有临床意义的氨基酸位置，只是替换成了不同的氨基酸，因此只能视为功能候选，而不能直接赋予相同的生理效应。
研究人员随后又分析了体外分化的红系前体细胞，发现135种独特血红蛋白替换，其中62种与健康组织中的替换重复出现，重叠显著性达到 P=4.06×10⁻⁴⁶。
与此同时，研究团队还采用纯化蛋白和重组蛋白做了正交验证。
121种免疫沉淀蛋白中检测到2,748次替换；纯化血红蛋白、GAPDH、PARK7和PRDX6中分别检测到60、31、27和27种替换。更有意思的是，一个在HEK293细胞中表达的外源重组抗体中，也发现了 45种无法由其编码序列或免疫球蛋白污染解释的替换。
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人类细胞持续产生DNA参考序列之外的蛋白质分子，并非单一数据集中的偶发现象。 |
这项研究最需要警惕的，恰恰也是最吸引人的地方
看到这些数字，很容易直接得出一个诱人的结论：
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“人类存在大量DNA没有编码的新功能蛋白。” |
目前的证据还不足以支持这么强的表述。
首先，没有RNA证据不能完全排除低频体细胞突变。
其次，质谱不同肽段的离子化效率不同，因此蛋白质变体之间的相对丰度尤其需要谨慎解释。
第三，一些看起来很有规律的氨基酸替换，确实可能来自样本制备过程。该研究已经通过实验确认C→A在特定条件下主要属于化学伪影，这也提醒我们：“质谱检测到了一个异常质量差”只是证据链的起点，而不是终点。
最后，该研究中的部分纯化蛋白验证实验只有单次重复。研究人员也明确说明，这些实验的目的主要是确认特定替换形式的存在，而不是进行严格的定量比较。
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因此，更稳妥的结论不是“这些蛋白质一定都有新的功能”，而是：蛋白质组中存在一个此前被严重低估的、由低频氨基酸替换构成的蛋白质型层级，其中一部分很可能来自非遗传性的翻译过程，并显示出重复性、环境依赖性和潜在功能相关性。 |
如果一个基因对应的不是一种蛋白，我们该怎样重新理解“变异”？
现代遗传学非常擅长研究一个问题：
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DNA发生变化之后，会产生什么表型？ |
但这项研究提出了另一个方向：
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即使DNA没有发生可遗传的变化，同一段遗传信息在被执行时，会不会生成一组略有不同的蛋白质分子？ |
如果答案是肯定的，那么蛋白质组就不能只被理解为基因组的静态“翻译结果”。
同一个基因、同一个细胞里，可能同时存在主导的参考蛋白质型，以及一群丰度较低的替代形式。多数可能迅速被降解，一部分可能接近中性，还有极少数可能改变酶活性、分子互作、氧结合能力，或者在营养压力等特定环境下改变细胞状态。
从这个角度看，遗传信息规定的也许不是每一个蛋白质分子的唯一序列，而是一个高度稳定、但并非绝对单一的蛋白质输出体系。
这也是该研究最值得继续关注的地方。
如果这些低频蛋白质型能够被系统调控，那么未来需要回答的就不只是“翻译为什么会出错”，而是：
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细胞是否会在某些情况下利用这种“不完美”，获得DNA突变之外的短暂表型多样性？ |
而这个问题，可能会把我们对基因型（genotype）、蛋白质型（proteoform）与表型（phenotype）之间关系的理解，再向前推进一步。
参考文献
