通过靶向蛋白水解"关闭"并"开启"肿瘤来源胞外囊泡使其向免疫原性表型偏移

尽管有大量证据表明肿瘤来源胞外囊泡(tumor-derived extracellular vesicles, TEVs)表现出促肿瘤或抗肿瘤表型，但药理学的努力主要集中在对其不加区分地抑制。本文提出一种"关闭再开启(TEVs off and on)"TEVs的策略，将其重定向至免疫原性表型。研究人员设计了一种用于TEV重编程的纳米蛋白水解靶向嵌合体(nanoproteolysis-targeting chimera, Nano-PROTAC)——EVOTAC，它由三部分组成，通过肿瘤生物标志物响应性可切割连接子将PROTAC(蛋白水解靶向嵌合体)与光敏剂(photosensitizer)整合，并自发自组装成超分子纳米结构。在肿瘤中(相对于正常组织)生物标志物引导激活后，EVOTAC最初通过选择性降解参与胞外囊泡(extracellular vesicle, EV)生物发生的细胞内蛋白来清除TEVs；随后局部激光照射重新激活EV生成，促使肿瘤细胞在光动力治疗(photodynamic therapy, PDT)诱导下主要产生免疫原性TEVs。通过这种开关策略产生的TEVs独立发挥多效作用：抑制肿瘤生长、迁移和转移，同时增加淋巴器官和肿瘤组织中成熟树突状细胞(dendritic cells, DCs)和细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTLs)。因此，这种TEV切换过程显著增强了光免疫治疗的先天和适应性免疫反应，导致三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)完全消退，并预防转移和复发。本研究强调了这种精准TEV调控治疗方法的潜力，鼓励进一步探索，为不断增长的EV靶向癌症免疫治疗概念增添了新维度。

研究背景与意义

肿瘤来源胞外囊泡(tumor-derived extracellular vesicles, TEVs)既可促肿瘤进展（传递促转移、免疫抑制分子如程序性死亡配体1 PD-L1、CD47），也可在受激条件下携带肿瘤相关抗原(tumor-associated antigens, TAAs)诱发抗肿瘤免疫，作为原位癌疫苗发挥作用。现有TEV靶向策略多为广谱抑制其生物发生或释放，忽略了TEVs双重功能及重编程为免疫原性表型的潜力。本研究发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》，提出并验证通过纳米蛋白水解靶向嵌合体(nanoproteolysis-targeting chimera, Nano-PROTAC, 简称EVOTAC)先降解EV生物发生关键蛋白关闭原有促瘤TEV分泌，再以光动力治疗(photodynamic therapy, PDT)诱导细胞重新分泌富含免疫原性信号（损伤相关分子模式 DAMPs、抑癌microRNA）的TEVs，实现TEV表型重编程，增强原位光免疫治疗效果并诱导长期免疫记忆。

主要关键技术方法

研究人员合成含环氧合酶-2(COX-2)靶向PROTAC（以吲哚美辛为配体、VHL结合肽ALAPYIP为E3连接酶招募基序）、组织蛋白酶B(cathepsin B, Cat B)可切割连接肽KRR及光敏剂Verteporfin(VPF)的三元共轭分子，在水相中自发自组装为无载体超分子纳米粒EVOTAC；通过分子动力学模拟、纳米颗粒示踪分析(nanoparticle tracking analysis, NTA)、Western blot鉴定COX-2及ATP结合盒亚家族A成员3(ABCA3)降解效率与TEV标志物；体外用4T1小鼠三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)细胞系及原代骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs)、CD8⁺T细胞共培养检测钙网蛋白(calreticulin, CRT)/高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1, HMGB1)/热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)暴露及DC成熟、T细胞活化；分离TEVs行蛋白质组及miRNA测序分析表型差异；建立4T1原位TNBC及CT26结肠癌小鼠模型，尾静脉注射EVOTAC后于瘤内积聚峰(3 h)或TEV清除后(6 h)行激光照射，评估瘤体生长、肺转移、免疫浸润(流式细胞术)、血清细胞因子及再攻击后免疫记忆。

研究结果

Design, preparation, and characterization of EVOTAC

共轭分子在水中经疏水作用自发组装为约101 nm球形纳米粒，在小鼠血清中稳定；紫外-可见及荧光光谱证实吲哚美辛与VPF特征吸收/发射；活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成能力与游离VPF相当；仅在Cat B存在时发生连接子裂解释放PROTAC，可被Cat B不可逆抑制剂Z-FA-FMK阻断，其它酶或酸性溶酶体条件不引起分解，表明具备肿瘤Cat B特异性激活特性。

Proof of concept for switching TEVs off and on with EVOTAC

4T1细胞内吞EVOTAC后Cat B裂解释放PROTAC，介导COX-2泛素化-蛋白酶体降解，下调其下游ABCA3（EV生物发生关键调控蛋白），使TEV分泌量显著下降（关阶段）；激光照射诱导PDT产ROS引发内质网应激与免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death, ICD)，上调ABCA3恢复EV生成且新分泌TEVs富含CRT、HMGBs、HSPs等免疫原性蛋白及抑癌miRNA，迁移/促T细胞耗竭能力减弱；该TEVs体外可促进DC成熟与CD8⁺T细胞增殖活化，移植实验中延迟亲本肿瘤生长并提高脾、瘤引流淋巴结(tumor-draining lymph nodes, TDLNs)及瘤内成熟DC与CTL比例。

Proteogenomic profiling to identify TEV phenotypes

与单纯COX-2抑制或单纯PDT(VPF+L)相比，EVOTAC关阶段使TEVs中促迁移(p-Akt1、纤连蛋白、基质金属蛋白酶9 MMP-9)及免疫抑制(PD-L1、CD47)蛋白大幅降低；开阶段(PDT后)TEVs免疫原性蛋白(HMGB1/2、HSPs)升高更显著，致瘤迁移能力丧失，DC成熟与T细胞活化更强；miRNA测序显示EVOTAC(+L)组致癌miR-21a-5p、miR-24-3p等下调，抑癌let-7家族及miR-690、miR-6238等特异上调，预测靶基因涉及Efnb2、Ikzf2（DC成熟/T细胞活化调控）及Rgs18、Acer3、Mdm4（抗凋亡/抑瘤），证实TEV被重编程为免疫原性表型。

EVOTAC-mediated photoimmunotherapy in the TNBC orthotopic model

尾静脉给药后EVOTAC较游离VPF在瘤内富集更高、循环更长，注射后6 h瘤内COX-2/ABCA3降解明显、TEV数目降至约一半；6 h后激光照射(EVOTAC +L^6h)组较3 h照射组产生更高免疫原性TEVs，促进脾细胞DC成熟更显著；原位TNBC模型中EVOTAC +L^6h组所有小鼠原发瘤完全消退(complete regression, CR)，而EVOTAC +L^3h组无CR；miRNA谱证实抑癌miR-129-5p、miR-205-3p等富集、致癌miR-182-3p等减少；用EV生物发生抑制剂GW4869阻断TEV生成则疗效消失，证实免疫原性TEVs贡献治疗效果；CT26模型亦见显著抑瘤及免疫激活，未见体重下降或主要脏器损伤、血液生化异常，提示良好安全性与肿瘤特异性靶向蛋白降解(targeted protein degradation, TPD)。

Inhibition of premetastatic niche formation

EVOTAC处理细胞来源TEVs使4T1细胞Transwell迁移能力下降、迁移相关蛋白表达降低；原位TNBC模型经EVOTAC +L^6h治疗后肺生物发光信号及大体/组织学转移结节显著少于对照组，肺组织MMP-9、纤连蛋白、p-Akt1降低，表明消除促转移TEVs并生成免疫原性TEVs可协同抑制前转移微环境形成与远端转移。

Immune responses to EVOTAC-mediated photoimmunotherapy

EVOTAC +L^6h组瘤内CRT⁺肿瘤细胞、胞外HMGB1/HSP70、成熟DC与CTL比例最高，调节性T细胞(regulatory T cells, T_regs)最少，TNF-α与IFN-γ升高、IL-10降低；完全消退小鼠一个月后对侧再接种肿瘤全部被排斥，脾CD8⁺T细胞中效应记忆T细胞(effector memory T cells, T_em, CD44⁺CD62L^low)比例及血清IFN-γ、TNF-α显著升高，证明诱导了适应性免疫记忆。

讨论与结论

本研究首次通过整合靶向蛋白降解(TPD)与PDT的无载体超分子Nano-PROTAC(EVOTAC)实现TEVs先关后开的重编程，使PDT诱导生成的TEVs偏向免疫原性表型。EVOTAC药物负载量达80.59%，Cat B可切割连接子屏蔽PROTAC活性确保肿瘤特异性COX-2降解，间接下调ABCA3抑制EV生物发生后再经PDT上调ABCA3重启EV分泌。蛋白组与miRNA测序证实重编程TEVs丢失促瘤/免疫抑制载荷、富集免疫刺激分子及抑癌miRNA。在三阴性乳腺癌与结肠癌模型中该策略引起完全原发瘤消退、抑制肺转移并诱导长期免疫记忆，效果优于单纯PDT或不当时机照射。局限在于ABCA3靠上游COX-2降解间接调控，未来可直接靶向ABCA3配体PROTAC优化。研究表明事件驱动(event-driven pharmacology)的PROTAC可调控病理生理过程超越配体本身占用驱动抑制效果，为EV靶向癌症免疫治疗提供新范式，EVOTAC来源免疫原性TEVs兼具个性化原位癌疫苗潜力。